Olá pessoal, tudo bem com vocês?
Hoje falaremos em como um extrato natural pode ser caracterizado. Como temos visto os extratos naturais possuem uma diversidade de compostos tanto do metabolismo primário quanto do secundário, diante disso, o nome usado é análise de metabolomas. Mas aí vem a pergunta, como caracterizar esse metaboloma? Como identificá-los?
Bem, esse metaboloma presente em um extrato vai depender da planta, da época do ano, da pluviosidade, clima.... há diversos interferentes, mas quando coletamos uma planta em um período e em um local determinado esses fatores influenciarão na composição desse extrato, assim como o método de extração e o solvente utilizado.
Pequenas mudanças na coleta, extração ou armazenamento da amostra afetam muito a estabilidade do metabólito e, portanto, podem levar a grandes mudanças no metaboloma observado (1).
As estratégias atuais da metabolômica dependem principalmente de quatro abordagens principais: cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS), eletroforese capilar acoplada a espectrometria de massa (CE-MS) e ressonância magnética nuclear (NMR) (2).
Vamos falar sobre a cromatografia primeiramente...
A cromatografia consiste em um método analítico que auxilia na pesquisa de forma eficiente e precisa. Fornece a separação e purificação de misturas e quando acopladas a um detector é capaz também de fornecer a identidade das moléculas presentes.
A cromatografia pode ser classificada quanto a:
· Forma física: cromatografia planar ou de coluna;
· Fase móvel: Gás inerte – cromatografia gasosa; Líquido – cromatografia liquida e Vapor pressurizado – cromatografia supercrítica;
· Polaridade das fases:
o Cromatografia gasosa: fase móvel inerte, separação ocorre devido às interações das moléculas da amostra com a fase estacionária;
o Cromatografia liquida (planar e coluna):
Cromatografia em fase normal – fase estacionária é mais polar do que a fase móvel;
Cromatografia em fase reversa – fase móvel é mais polar do que a fase estacionária;
A partir dessas classificações surgem uma imensa variação de técnicas cromatográficas acopladas a detectores no intuito de separar, purificar e identificar as misturas de forma mais precisa.
Na postagem de hoje falaremos apenas as cromatografias planares.
Planar
As técnicas de cromatografia planar compreendem mecanismos de separação por adsorção. Adsorção é o processo pelo qual átomos, moléculas ou íons são retidos na superfície de sólidos através de interações de natureza química ou física.
Cromatografia em Papel (CP)
É uma técnica que inclui cinco etapas experimentais, mancha, separação e formação das bandas, secagem, pulverização/imersão e desenvolvimento de cor. O aparelho compreende uma câmara de vidro e uma fase estacionária, que é um papel de filtro feito de celulose. O papel de filtro é pendurado na parte superior e suspenso na câmara de vidro.
Com isso, o extrato a ser separado é adicionado no fundo do papel filtro e o solvente é então despejado no fundo do recipiente para servir como uma fase móvel. A fase móvel imediatamente começa a subir junto com o papel de filtro; a separação é realizada pelo movimento ascendente da fase móvel via ação capilar.
Os compostos que são solúveis irão se mover junto com o solvente e aderir ao papel de filtro com base em sua solubilidade. A velocidade de separação depende do tipo de papel de filtro usado. O movimento do líquido e o processo de separação são mais rápidos de acordo com a espessura do papel utilizado, quanto mais espesso mais rápido.
A identificação de cada composto separado é feita calculando o fator de retenção, que é a razão entre a distância percorrida pelo composto e a distância percorrida pelo solvente. As vantagens desta técnica incluem simplicidade e custo-benefício, muito sensível a pequenas quantidades de material.
As desvantagens incluem o consumo de tempo e a fragilidade do papel, que pode ser destruído por produtos químicos, assim como a identificação insuficiente devido a compostos com o mesmo tempo de retenção.
Figura 1. Imagem ilustrativa da cromatografia de papel. Imagem obtida: (3)
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
É uma técnica analítica que utiliza placas que podem ser de cobre, plástico ou folha de alumínio, estas placas são revestidas por uma fina camada de material adsorvente, como sílica, óxido de alumínio ou celulose. Essa fina camada adsorvente é denominada de fase estacionária.
A amostra a ser analisada é adicionada nessa placa e a fase móvel logo em seguida é adicionada e através da ação capilar bandas são formadas pois percorrem de maneira distinta nessa placa, ocorrendo desta forma a separação dos compostos presentes na amostra. Após a separação e formação das bandas a secagem dessa placa é feita e subsequentemente foto documentada e normalmente utiliza-se diferentes fontes de luz para visualização da banda ou ainda através da pulverização de reagentes químicos.
Essa última etapa é insuficiente para análise e identificação correta dos compostos, devido à baixa especificidade para compostos que possuem grupos funcionais e fator de retenção semelhantes. Para identificação completa dos compostos dispostos agora em bandas pode-se usar detectores como espectrometria de massas.
Abaixo segue um exemplo desta técnica acoplada ao espectrômetro de massas para identificação de compostos do extrato de flores da espécie Datura metel.
Figura 2. Resumo da Técnica de Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Neste estudo os autores utilizaram a CCD e após a separação por capilaridade a placa utilizada foi cortada com tesoura zigue zague formando duas peças com pontas triangulares. Depois disso, os autores utilizaram metanol como solvente nas pontas triangulares para induzir a Ionização por Electrospray (Electrospray Ionization Mass Spectrometry – ESI). O ESI é uma técnica usada na espectrometria de massas para produzir íons usando um eletropulverizador em que uma alta voltagem é aplicada a um líquido para criar um aerossol. Esta técnica segundo os autores permitiu escanear a superfície da placa CCD desenvolvida e caracterizar analitos em toda a faixa. Os autores também relatam que foi possível elucidar bandas antes difíceis de serem visualizadas. Imagem obtida: (4)
Conclusão
A cromatografia planar é simples e de fácil acesso. Foi amplamente utilizada e é utilizada até hoje. No entanto, percebe-se as desvantagens quando se fala sobre a identificação precisa dos compostos. Com isso, é necessário o acoplamento de detectores que se ajustem a esse tipo de técnica.
No próximo artigo abordaremos o uso da cromatografia por colunas que revolucionou a forma de separação assim como os detectores utilizados para a identificação destes compostos.
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Referências
(1) Salem, M. A., de Souza, L. P., Serag, A., Fernie, A. R., Farag, M. A., Ezzat, S. M., & Alseekh, S. (2020). Metabolomics in the context of plant natural products research: From sample preparation to metabolite analysis. In Metabolites (Vol. 10, Issue 1). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/metabo10010037
(2) Abubakar, A. R., & Haque, M. (2020). Preparation of medicinal plants: Basic extraction and fractionation procedures for experimental purposes. In Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences (Vol. 12, Issue 1, pp. 1–10). Wolters Kluwer Medknow Publications. https://doi.org/10.4103/jpbs.JPBS_175_19
(3) Priyadarshini, Rekha & Marshall Raj, Gerard & Shewade, Deepak. (2016). Chromatography - the essence of bioanalysis. European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 3. 366-77.
(4) S. C. Cheng, S. M. Bhat, C. W. Lee, & J. Shiea. Simple interface for scanning chemical compounds on developed thin layer chromatography plates using electrospray ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. (2019). https://doi.org/10.1016/j.aca.2018.10.042
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