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Dentro ainda do contexto de caracterização dos extratos, além de análises cromatográficas, através da quantificação de algumas substancias e/ou atividade também é possível caracterizar parcialmente esse extrato.
Determinar a presença de compostos fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante de um extrato é uma das primeiras etapas após a obtenção do mesmo.
Diante disso, o artigo de hoje será a respeito da classe dos compostos fenólicos e quanto à atividade antioxidante que estes possuem.
Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos são um grupo de substâncias amplamente encontradas na natureza. Trata-se de um grande e complexo grupo que possui cerca de 8000 subclasses fenólicas as quais já foram detectadas em inúmeras plantas, vegetais, frutas e produtos industrializados.
São responsáveis pela pigmentação, ou seja, são responsáveis por dar a aparência colorida aos alimentos além das reações de defesa das plantas contra agressões externas (1). Normalmente, estes compostos são classificados pela sua estrutura de origem, pela sua função biológica e pela sua natureza química.
Estes subgrupos podem também diferir significativamente em termos de estabilidade, biodisponibilidade e funções fisiológicas relacionadas com a saúde humana.
A determinação destes compostos é uma das primeiras etapas na caracterização dos extratos. Com isso, vamos aprender um pouco sobre os métodos para qualificar e quantificar esses compostos.
Métodos Analíticos por espectrofotometria
Fenóis Totais
Para determinação de fenóis totais pode ser realizada por espectrofotometria usando reagentes diferentes na intenção de gerar um produto que será determinado por absorbância pelo espectrofotômetro. Existem alguns métodos como: método de Folin-Denis, Folin-Ciocalteu, azul de Prússia, teste da vanilina e Hagerman e Butler (2,3).
Método de Folin-Denis
Amplamente utilizado é descrito por Swain e Hillls é baseado na redução do ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico pelas hidroxilas (OH) dos compostos fenólicos, produzindo um complexo de coloração azul.
A reação ocorre em meio alcalino e a solução saturada de carbonato de sódio é a base mais indicada. O método de Folin-Denis, no entanto, não é um método específico, pois determina todos os compostos fenólicos presentes, além de substâncias redutoras adicionadas aos alimentos ou naturalmente presentes que podem interferir nos resultados.
Esse tipo de ensaio requer um padrão, normalmente os mais utilizados são o ácido tânico e a catequina (3).
Método Folin-Ciocalteu
O Folin-Ciocalteu também é amplamente utilizado por se apresentar mais sensível que o anterior descrito, outro fator é que ele apresenta menor tendência em gerar precipitados.
Mas assim, como o Folin-Dennis o numero de grupos hidroxilas ou de grupos potencialmente oxidáveis é que levará a formação da cor. O grupo fenólico deve estar na forma de fenolato para que os reagentes adicionados se oxidem.
As moléculas reduzidas são azuis e as não reduzidas são amarelas. O padrão normalmente utilizado é o ácido gálico (3).
Observação: Ambos métodos Folin-Denis ou Folin-Ciocalteu não são específicos pois detectam compostos fenólicos totais no extrato, incluindo alguns grupos proteicos extraíveis. Outra desvantagem é a interferência de reduzir substâncias como ácido ascórbico.
Método Price e Butler – Azul de Prússia
Este método se baseia na redução do íon férrico para íon ferroso pelos grupos OH presentes nos compostos fenólicos, essa conversão levará a formação de um complexo de ferrocianeto ferroso, conhecido como azul de Prússia.
A habilidade dos compostos fenólicos em reduzirem o íon férrico é totalmente dependente dos grupos OH e do grau de polimerização destes compostos. Este ensaio também é inespecífico e há sérios problemas relacionados com a impregnação da cor azul na vidraria utilizada, especificamente nas cubetas, influenciando na leitura da amostra (3).
Teste da vanilina
Esse teste foi descrito por Swain e Hillls é amplamente utilizado quando há necessidade de determinar as proantocianinas (taninos condensados) nos extratos. A reação acontece com o uso de uma solução a 1% de vanilina que reagirá com os compostos fenólicos mais ácidos. Este teste é específico para flavan-3-ols, di-hidrochalconas e proantocianinas (3).
Método de Hagerman e Butler
Os taninos normalmente interagem com proteínas, formando complexos os quais podem ser separados por centrifugação quando dissolvidos com dodecil sulfato de sódio (SDS) em meio alcalino. Após essa separação o uso de cloreto férrico reagirá com o tanino formando um composto colorido que deste modo poderá ser lido via espectrofotômetro (3).
Flavonoides
Para determinação e quantificação de flavonoides pode-se adicionar reagentes como AlCl3, H3BO3 (ácido bórico), NAOH e quercetina (4).
Com a adição de AlCl3 formará um complexo metálico Al3+-flavonoide que servirá para distinguir os flavonoides que contem OH livre nas posições 5- ou 3-.
Os flavonoides que não tiverem esse grupo OH livre não formará o complexo metálico. A coloração da reação torna-se amarelada que é indicativa da presença de flavonas e flavonóis (5,6).
Quando se usa o H3BO3 forma um complexo apenas com grupos de flavonoides que contem grupos orto-dihidroxi ou catecol. Com isso a reação com ácido bórico determina hidroxila livre na posição C-5 no núcleo flavonoídico, evidenciando a presença de flavonóis (5,6).
O uso de NaOH também é capaz de formar complexos que apresentará coloração amarela, sugerindo a presença de flavonas, flavonóis, flavononas, chalconas e isoflavonas. Este tipo de reação é menos específico (5,6).
Outra forma de determinar flavonoides é baseado na reação de oxidação da quercetina em solução aquosa neutra contendo N-bromo-succimida na presença de fenol. Essa reação levará a formação de um composto de coloração violeta (5,6).
Atividade antioxidante
A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura química. Estas características desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo.
Os intermediários formados pela ação de antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias.
Métodos de avaliação da atividade antioxidante
Atualmente, existem vários métodos de se avaliar o potencial antioxidante de compostos naturais. Esses métodos são classificados em dois grupos: captação de radicais livres e determinação da oxidação de uma molécula alvo.
É preciso levar em conta a aplicabilidade de cada ensaio, sendo recomendado duas ou mais técnicas, pois um ensaio isolado não é suficiente para determinar a atividade antioxidante total (7).
Existem alguns métodos para se avaliar essa atividade antioxidante, dentre eles temos:
2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid – ABTS
Trata-se de um composto cromóforo estável quimicamente, apresentando alta solubilidade em água. Gerado através de reações enzimáticas ou químicas, o ABTS permite ser solubilizado em meios orgânicos e aquosos assim determinando a atividade, dependendo da natureza dos compostos.
Possui excelente estabilidade, sendo considerado um dos testes mais rápidos e efetivos, oferecendo resultados reprodutíveis, além de vários máximos de absorção e uma boa solubilidade, permitindo análises de compostos tanto de natureza lipofílica como hidrofílica (7).
2,2-difenil1-picrilhidrazil – DPPH
Bastante utilizado em avaliações antioxidantes, é um método simples, preciso, rápido e mais econômico. Possui dois tipos de mecanismos de reação, os quais resultam na neutralização ou redução dos radicais livres responsáveis pela oxidação.
Um dos mecanismos é baseado na transferência de átomo de hidrogênio e o outro, na de elétrons. Ele foi desenvolvido com intuito de determinar as propriedades antioxidantes de várias substâncias usando radicais livres estáveis, sendo posteriormente modificado para determinar o potencial antioxidante de compostos fenólicos e de amostras biológicas, a partir da utilização de uma concentração eficaz que inibi 50% da concentração inicial do radical (8).
Conclusão
Como pode-se entender há diversas formas para quantificar compostos fenólicos. Aqui apresentamos as mais simples por métodos espectrométricos. Esses compostos como um todo possuem instabilidade frente a diferentes pHs podendo alterar a natureza do composto, além disso, a possibilidade de interferência na leitura com outros compostos, como: proteínas, ácidos nucléicos e aminoácidos devem ser considerados.
Diante disso, o desenvolvimento de um UV satisfatório é uma tarefa difícil, além do material a ser analisado. No entanto, esse tipo de técnica é frequentemente usado para identificação de combinações fenólicas isoladas, particularmente flavonoides e também para identificar a presença de combinações fenólicas predominantes naquele extrato, assim como para determinar o potencial antioxidante.
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Até o próximo artigo.
Referências:
1. Arnoso BJ de M, da Costa GF, Schmidt B. Biodisponibilidade e classificação de compostos fenólicos. Nutrição Brasil. 2019;18(1):39. doi:10.33233/nb.v18i1.1432
2. Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso) - Compostos fenólicos em alimentos - uma breve revisão. Accessed September 21, 2020. http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0073-98552007000100001&lng=pt
3. Furlong EB, Colla E, Bortolato DS, Baisch ALM, Souza-Soares LA. Avaliação do Potencial de Compostos Fenólicos em Tecidos Vegetais. Vetor. 2003;13:105-114.
4. Pessoa UF. Atividades Biológicas dos Flavonoides : Atividade Antimicrobiana. Published online 2013.
5. Oliveira KADM, Oliveira GV de, Batalini C, Rosalem JA, Ribeiro LS. Atividade antimicrobiana e quantificação de Flavonoides e Fenóis totais em diferentes extratos de Própolis. Semina: Ciências Biológicas e da Saúde. 2013;33(2):211-222. doi:10.5433/1679-0367.2012v33n2p211
6. Lima MA de, Teixeira LN, Sousa PB de, Silva MDJM da, Carvalho LFM de. DETERMINAÇÃO DE FENÓLICOS, FLAVONOIDES E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA PIMENTA DEDO-DE-MOÇA (Capsicum baccatum var. pedulum) COMERCIALIZADA NA CIDADE DE IMPERATRIZ - MA. VII Congresso Norte-Nordeste de Pesquisa e Inovação (CONNEPI). Published online 2012:1-7.
7. Métodos Para Determinação da Atividade Antioxidante de Frutos | Journal of Health Sciences. Accessed September 21, 2020. https://revista.pgsskroton.com/index.php/JHealthSci/article/view/885
8. Oliveira GLS. Determinação da capacidade antioxidante de produtos naturais in vitro pelo método do dpph•: Estudo de revisão. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. 2015;17(1):36-44. doi:10.1590/1983-084X/12_165
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